换种思路做植物抗病基因克隆居然能发40分文章 | 新方案

 

使用诱变和序列捕获快速克隆植物中的抗病基因

Rapid cloning of disease-resistance genes in plants using mutagenesis and sequence capture

年份：2016

期刊：Nature Biotechnology

IF：41.667

机构：英国约翰伊恩斯中心（John Innes Centre）和澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）

 

1研究背景

（1）抗病基因（R-Genes）

植物在抵抗病原微生物的入侵的过程中，disease resistant genes（R基因）起到了十分关键的作用。而使用传统的育种方法，筛选出抗病的小麦品种需要长达5-15年的时间，因为很多有害等位基因和R基因存在连锁不平衡现象，通过染色体重组将两种性状进行分离比较困难。如下图所示，着丝粒区更容易发生染色体重组交换的现象，假如R基因和部分有害基因遗传距离过近或者本身存在连锁阻力，那么传统的育种方法很难培育出新的品系。小麦作为异源六倍体的大基因组植物，在育种上面临诸多的挑战！

小贴士：连锁不平衡（linkage disequilibrium）即两个基因相互连锁，发生染色体之间重组概率偏低，多少比例表示遗传距离是多少cM（厘摩尔）。

（2）R-Genes分离难点

R基因家族具有序列多样性等特点，所以鉴定R基因、分离R基因和克隆R基因成为无法解决的一大难题。构建遗传图谱并进行图位克隆的方法难以将这些R基因全部分离出来。加之连锁不平衡现象，使得传统的育种方法无法培育出真正的抗病小麦品种。

（3）Sr22和Sr45基因是迄今为止在小麦的五个主要的主导Sr基因中的两个。所有这五个基因（Sr33，Sr35和Sr50，Sr22和Sr45）均表现出对茎锈病Ug99种族群体的抗性，而Sr22、Sr33和Sr50赋予多种病原体种群抗性。已经在小麦中遗传鉴定了约60种Sr基因，其中几种Sr在所有植物发育阶段也提供了广泛的抗性，例如Sr26、Sr32、Sr39、Sr40和Sr47。

2MutRenSeq  

（1）原理

使用甲基磺酸乙酯（EMS）方法构建小麦突变体，使用液相捕获技术，对R基因进行快速克隆。

小贴士：EMS是一种特殊的诱变剂，属于烷化剂诱变最常用的一种。目前这种技术已经广泛用于植物突变体的构建，属于常见的育种方法，经济高效。相比于X光或宇宙辐射育种，EMS一般只会引起碱基的点突变，而不是出现大规模的染色体易位缺失等情况。2013年，日本科学家利用EMS技术，使用BSA分析策略得到了水稻耐盐基因，在不到3年时间内培育出高耐盐的水稻株系，该结果发表在Nature Biotechnology上。

（2）结果

对小麦使用EMS诱导后，使用特异性的RNA捕获探针对目标区域进行富集（即靶向区域液相捕获技术），然后进行上机测序。通过比对野生型和抗性突变体的序列，获得茎锈病抗性基因Sr22和Sr45，转化为抗茎锈病小麦品系。

（3）优点

快速鉴定抗病基因（<24个月）、成本低廉。

3MutRenSeq抗性基因克隆的突变基因组学策略

（1）诱变

对野生型小麦进行EMS诱变处理，得到M2品系。接下来对M2品系中具有抗茎锈病株性状的株系做进一步筛选，得到易感品系和抗性品系。

（2）NLR靶向捕获文库构建和测序

a叶组织提取总基因组DNA并进行DNA定量和文库的制备。从小麦叶片组织中提取总DNA并进行靶向文库制备。针对NLR设计出特异性的RNA捕获探针，分别对易感品系和抗性品系的特定目标区域（NLR）进行捕获。目标区域富集完毕后，进行上机测序，测序平台为Illumina Hiseq和MiSeq。

b NLR读取和比较。使用BWA比对软件对下机数据进行序列比对，得到sam文件。使用samtools转换出这些比对上的短reads序列，使用de novo组装策略得到足够长的contigs，将这些contigs与靶向文库中最原始序列进行blast比对，换句话说，将野生型基因与捕获富集文库的序列比对，确定潜在SNP位置。

小贴士：BWA是一种序列比对软件，和bowtie一样能够用于将二代测序下机数据中短reads比对到参考基因组上。BWA的应用场景是DNA-Seq较多，bowtie则用于RNA-Seq较多。而samtools是一款十分强大的软件，可以将sam格式的文件转换出多种格式文件，如fasta序列信息等。

（3）Sr22基因富集

a按照标准的RenSeq的方式进行构建，并进行了微调。为了在体外获得转录序列，使用Sanger一代克隆测序验证发现，该片段来源于Sr22的5'端。

b使用BLASTx（核酸与蛋白比对模式）将Sr22 5'端的某个contig（contig_10555_1）与NCBI_nr库中非冗余蛋白质序列比对，发现相似度评分最高的比对结果是来自Aegilops tauschii（节节麦）的抗病基因类似物（RGA）的3'端。确定的最为相似的contig_3841_1是与Aegilops tauschii的5'区域同源的唯一序列。

（4）RNASeq转录组测序

对Schomburgk（携带Sr22抗性基因）品系进行转录组测序。为了进一步证实整个Sr22序列的真实性和可靠性，使用Tophat最终定位将Sr22基因定位到小麦染色体的特定区域。

（5）L-PCR验证

使用GoTaq Long PCR Master Mix（Promega）和引物通过PCR扩增后，使用一代克隆测序进一步证实了Sr22的ORF全长序列。

图1抗性基因克隆的突变基因组学策略

4MutRenSeq 获得茎锈病抗性基因Sr22、Sr45

（1）使用Schomburgk和CS1D5406种子进行EMS诱变筛选，鉴定出6个独立的敏感突变体，我们对NLR和6个突变体基因组和转录组进行测序。

（2）对Schomburgk（Sr22）叶片转录组进行了测序，将转录组读取以及5'和3'RACE产物比对到基因组序列以确定Sr22外显子结构，该基因具有翻译起始至终止密码子的5,918bp的4个外显子和3个内含子，编码序列长度为2,826bp，5'和3'UTR为75bp和335bp。

（3）使用MutRenSeq克隆CS1D5406抗茎锈病基因Sr45，该基因跨度为5,822bp，包括226bp的5'UTR，3,693bp的编码序列，2个内含子395和113bp，以及590bp的3'UTR。此外，通过基因组步行鉴定了包括整个3'UTR（通过3'RACE鉴定）的1,508bp的Sr45下游序列。我们通过L-PCR和测序证实了这些序列。

图2获得茎锈病抗性基因Sr22、Sr45流程和通过EMS诱导的易感突变体克隆Sr22和Sr45基因

（a，c）Schomburgk（Sr22），CS1D5406（Sr45），突变体和敏感品种摩洛哥和中国春季的茎锈病感染表型。如上所述，用两个全叶期的幼苗接种茎锈菌孢子。选择与亲本品系（Schomburgk和CS1D5406）相比，显示较高感染类型的品系作为敏感突变株（a，c）。在纯合的M3和M4后代中证实了突变体中Sr22和Sr45抗性的失活。 （b，d）显示内含子，外显子边界的Sr22（b）和Sr45（d）基因，蛋白质结构域结构（彩色框），5'和3'UTR（白盒子）以及SNV位点*。由RenSeq获得的Contigs显示为灰色。通过局部RenSeq和/或基因组步行扩增Sr22和Sr45重叠群，通过基因组DNA的PCR扩增和测序确认全长Sr22和Sr45序列。

5Sr22基因转为抗茎锈病小麦

使用引物S22F14和S22R4从Schomburgk PCR扩增编码Sr22基因和5'（1.292kp）和3'（0.605kb）调节区的7.815kb的基因组片段。使用农杆菌侵染的方法将携带Sr22基因的质粒载体导入小麦品种，回收携带Sr22基因的六个独立的初级转基因植物以及没有Sr22转基因的植物，并在昼夜温度为23℃，16小时光照和8小时黑暗条件下的自动生长箱中生长。接种在澳大利亚种族98-1,2,3,5和6，在高湿度的封闭透明塑料盒中孵育24小时后，将植物恢复至原始生长条件并观察其锈病情况。在接种14天后进行锈病感染评分，其中所有6个转基因植物均显示出抗锈性表型。

图3含有源自Schomburgk的Sr22基因的野生型和转基因小麦品系的茎锈病感染表型

6论文亮点

利用EMS诱导的方式获得了抗病品种，并结合RenSeq方法制备NLR特异性诱饵库得到NLR序列^[1]，结合转录组测序获得编码区域，利用L-PCR进行验证Sr22开放阅读框序列。对与抗病基因的解读不仅于基因和转录层面^[2-6],并将Sr22基因成功导入小麦品种，实现了工程化。

参考文献

[1] Resistance gene enrichment sequencing (RenSeq) enables reannotation of the NB-LRR gene family from sequenced plant genomes and rapid mapping of resistance loci in segregating populations[J]. PLANT JOURNAL. 2013

[2] Naeela Qureshi, Harbans Bariana, Kerrie Forrest et al.Fine mapping of the chromosome 5B region carrying closely linked rust resistance genes Yr47 and Lr52 in wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics. 2017.

[3] Caroline Pandin, Martine Caroff, Guy Condemine et al. Antimicrobial Peptide Resistance Genes in the Plant Pathogen Dickeya dadantii[J]. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.2016.

[4] Amit Gal-On, Marc Fuchs, Stewart Gray^. Generation of novel resistance genes using mutation and targeted gene editing[J]. Current Opinion in Virology. 2017

[5] Utilizing “Omic” Technologies to Identify and Prioritize Novel Sources of Resistance to the Oomycete Pathogen Phytophthora infestans in Potato Germplasm Collections[J]. Front Plant Sci. 2017

[6] Comparative analysis of targeted long read sequencing approaches for characterization of a plant’s immune receptor repertoire[J]. BMC Genomics. 2017

小编点评

针对小麦、棉花、花生等基因组较大的异源多倍体植物，液相捕获技术和多重PCR技术正在展现出巨大的威力。无论是全基因组重测序还是简化基因组重测序都无法满足育种专家们日益增长的需求，人们急需一种廉价省时间的方法来解决这些难题！一些重要农艺性状的QTL，使用传统图位克隆的方法仍然无法获得育种专家想要的功能基因，液相捕获技术专门为此运应而生。此外，传统的SSR标记和RFLP标记存在密度较低、性状区域定位过大等问题。这时候诸如液相捕获和多重PCR等新型的靶向区域捕获技术在标记加密等方面有了新的应用场景。

你对本文使用定制化探针捕获基因感兴趣吗？

请把您的需求留言给我们，联川生物基因捕获专家会与您细致交流。

联川生物VariantBaits^TM定制化捕获探针已应用于下列研究项目:

1. Lactase nonpersistence is directed by DNA-variation-dependent epigenetic aging. (2016) Nature Structural & Molecular Biology 23 (6) :566-573.

2. Library-free methylation sequencing with bisulfite padlock probes. (2012) Nature Methods 9(3), 270-2.

3. Efficient targeted resequencing of human germline and cancer genomes by oligonucleotide selective sequencing. (2011) Nat Biotechnol 29, 1024–27.

4. Systematic comparison of three genomic enrichment methods for massively parallel DNA sequencing. (2010) Genome Res 20(10), 1420-31.

5. High-throughput method for analyzing methylation of CpGs in targeted genomic regions. (2010) Proc Natl Acad Sci 107(28), 12587-92.

相关阅读：